大盘点：蛋白质分析检测的几种实验方法

准确测定蛋白质浓度是生物学和生物化学实验中一项基础且关键的任务，尽管这一目标看似直观可达，但每种检测方法背后都蕴含着复杂的生物化学原理。为了助力研究者高效、精准地完成蛋白质浓度测定，以下将概述几种常用的蛋白质含量测定技术的核心理念及其操作时的注意事项。

1. Bradford法（考马斯亮蓝法）

考马斯亮兰法（bradford法）是目前灵敏度最高的蛋白质测定法，它改善了双缩脲法（biuret法）和folin—酚试剂法（lowry法）的明显缺点和许多限制。它的测定范围为10-100µg蛋白质，微量测定法测定范围是1－10µg蛋白质。此反应重复性好，精确度高，线性关系好。标准曲线在蛋白质浓度较大时稍有弯曲，这是由于染料本身的两种颜色形式光谱有重叠，试剂背景值随更多染料与蛋白质结合而不断降低，但直线弯曲程度很轻，不影响测定。

检测原理：考马斯亮蓝G-250与蛋白质定量结合后，其对可见光最大吸收峰从465nm变为595nm。在考马斯亮蓝G-250过量且浓度恒定的情况下，当溶液中的蛋白质浓度不同时，就会有不同量的考马斯亮蓝G-250从吸收峰为465nm的形式转变成吸收峰为595nm的形式，而且这种转变有一定的数量关系。一般情况下，当溶液中的蛋白质浓度增加时，显色液在 595nm 处的吸光度基本能保持线性增加。

优点：1.灵敏度高：比lowry法高4倍，因为蛋白质―染料复合物具有很高的消光系数；2.检测快速简便：其颜色可以在1小时内保持稳定，不用像lowry法那样严格地控制时间；3.干扰物质少：不受常见盐离子、酒精、酚类、游离氨基酸和缓冲剂、络合剂的影响。

缺点：1.基准物不稳定：由于各种蛋白质中的精氨酸和芳香族氨基酸的含量不同,因此用于不同蛋白质测定时有较大的偏差，在制作标准曲线时通常选用g—球蛋白为标准蛋白质，以减少这方面的偏差。2.曲线非线性：标准曲线也有轻微的非线性，因而不能用beer定律进行计算，而只能用标准曲线来测定未知蛋白质的浓度。3.仍有干扰物质：虽然大部分实验室常见试剂均不能对考马斯亮蓝法的检测结果造成影响，但大量去污剂的存在对产物的颜色影响非常大且不易消除。

注意事项：1.如果定要求很严格，可以在试剂加入后的5－20min内测定光吸收，因为在这段时间内颜色是最稳定的。2.测定中，蛋白－染料复合物会有少部分吸附于比色杯壁上，实验证明此复合物的吸附量是可以忽略的。测定完后可用乙醇将蓝色的比色杯洗干净。

2. Lowry法（福林酚法）

folin―酚试剂法（lowry法）曾是应用最广泛的一种方法，由于其第二种试剂的配制较为困难，近年来逐渐被考马斯亮兰法所取代。此法的显色原理与双缩脲方法是相同的，只是加入了第二种试剂，即folin―酚试剂，以增加显色量，从而提高了检测蛋白质的灵敏度。进行测定时，加folin―酚试剂要特别小心，因为该试剂仅在酸性ph条件下稳定，但上述还原反应只在ph=10的情况下发生。故当folin一酚试剂加到碱性的铜―蛋白质溶液中时，必须立即混匀，以便在磷钼酸―磷钨酸试剂被破坏之前，还原反应能发生。

检测原理：在碱性条件下，蛋白质中的肽键与铜结合生成复合物。folin―酚试剂中的磷钼酸盐―磷钨酸盐被蛋白质中的酪氨酸和苯丙氨酸残基还原，产生深蓝色（钼蓝和钨蓝的混合物）。在一定的条件下，蓝色深度与蛋白的量成正比。

优点：灵敏度高：对水溶性蛋白质含量的测定很有效；

缺点：1.费时：folin―酚试剂在碱性环境下易变性，需精准控制反应及测量时间；2.操作步骤繁琐；3.标准曲线非线性；4.专一性差：本方法干扰物质较多，对双缩脲反应发生干扰的离子，同样容易干扰lowry反应，且对后者的影响要大得多。

注意事项：操作过程需确保反应体系处于碱性环境，且需精确控制反应时间，以避免颜色过深影响读数准确性。

3. BCA法（二喹啉甲酸法）

BCA（Bicinchoninic Acid）法是Lowry测定法的一种改进方法。与Lowry方法相比，BCA法的操作更简单，试剂更加稳定，几乎没有干扰物质的影响，灵敏度更高（微量检测可达到0.5μg/ml），应用更加灵活。

检测原理：蛋白质分子中的肽键在碱性条件下能与Cu2+络合生成络合物，同时将Cu2+还原成Cu+。二喹啉甲酸及其钠盐是一种溶于水的化合物，在碱性条件下，可以和Cu+结合生成深紫色的化合物，这种稳定的化合物在562nm处具有强吸收值，并且化合物颜色的深浅与蛋白质的浓度成正比。故可用比色的方法确定蛋白质的含量。

优点：1.灵敏度高；2.操作简单；3.稳定性较高，适用于表面活性剂存在下的蛋白质浓度检测，可兼容高达5%的SDS，TritonX-100及Tween等。

缺点：BCA方法的检测结果也仍受到蛋白质内半胱氨酸，酪氨酸，色氨酸含量的影响。如果溶液中含有与铜离子反应的螯合剂比如EDTA或者还原性试剂比如DTT、β-巯基乙醇，结果也将受到很大程度的影响。

注意事项：BCA试剂对温度敏感，需在指定温度下孵育反应；同时，注意避免样品中还原性物质的干扰。

4. 紫外分光光度法

紫外吸收法可测定0.1-0.5mg/ml的蛋白质溶液，此操作简便，测定迅速，不消耗样品，低浓度盐类不干扰测定。因此，此法在蛋白质的制备中广泛应用。

检测原理：大多数蛋白质分子结构中含有芳香族氨基酸（酪氨酸和色氨酸）残基，使蛋白质在280nm的紫外光区产生最大吸收。这一波长范围内的吸收值与蛋白质浓度的成正比，蛋白质浓度根据Beer-Lambert定律计算。

A=E•C•l

A代表吸光度，E代表消光系数，C代表蛋白质浓度，l代表光径长度。消光系数可以根据蛋白质序列估测。

优点：1.简单快速；2.不消耗样品：检测过程中不对样品进行处理，故而测定后能回收样品。

缺点：1.普适性差：不同的蛋白质有不同的酪氨酸和色氨酸含量。对那些与标准蛋白质中酪氨酸和色氨酸含量差异大的蛋白质，有一定的误差。故要准确测量，必须要有待测蛋白质的纯品作为参考。2.曲线非线性：标准曲线也有轻微的非线性，因而不能用beer定律进行计算，而只能用标准曲线来测定未知蛋白质的浓度。3.干扰物质多：若样品中含有嘌呤、嘧啶及核酸等能吸收紫外光的物质，会出现较大的干扰。

注意事项：该方法受样品中核酸和其他含共轭双键化合物的影响较大，需根据实际情况进行校正；同时，注意仪器的校准和稳定性。

5. 凯氏定氮法

凯氏定氮法是测定化合物或混合物中总氮量的一种方法。由于蛋白质含氮量比较恒定，可由其氮量计算蛋白质含量，故此法是经典的蛋白质定量方法。蛋白质的含氮量约为16%，即1克（蛋白质中的）氮相当于6.25克蛋白质，用凯氏定氮法测出的含氮量乘以6.25,即得样品中蛋白质的含量。

样品粗蛋白含量＝总氮量×6.25

检测原理：在有催化剂的条件下，用浓硫酸消化样品将有机氮都转变成无机铵盐，然后在碱性条件下将铵盐转化为氨，随水蒸气蒸馏出来并为过量的硼酸液吸收，再以标准盐酸滴定，就可计算出样品中的氮量。

优点：1.测量范围广：可用于所有的蛋白质分析中；2.操作简单；3.测量浓度下限低：改进方法（微量凯氏定氮法）可测定样品中微量的蛋白质。

缺点：准确性不佳——6.25为含氮量换算为蛋白质含量的系数，这个系数来自蛋白质平均含氮量为16％，实际上各种蛋白质因氨基酸组成不同，含氮量不完全相同。

注意事项：操作复杂，需精确控制消化和蒸馏过程；同时，注意样品中其他含氮化合物的干扰。

6.图片双缩脲法

图片双缩脲法（biuret法）测定范围为1-10mg蛋白质，常用于需要快速，但并不需要十分精确的蛋白质测定。紫色络合物颜色的深浅与蛋白质浓度成正比，而与蛋白质分子量及氨基酸成分无关，故可用来测定蛋白质含量。

检测原理：双缩脲试剂是碱性的含铜试液，呈蓝色，当底物中含有肽键时（多肽），试液中的铜与多肽配位，配合物呈紫色。在紫外可见光谱中的吸收峰为540nm，可通过比色法分析浓度。

优点：1.测定速度快；2.干扰物质少；3.普适性高：不同蛋白质产生的颜色深浅相近。

缺点：1.灵敏度差；2.存在干扰物质：硫酸铵、三羟甲基氨基甲烷、一些氨基酸和EDTA等会干扰该反应。

综上所述，选择合适的蛋白质浓度测定方法需根据实验目的、样品特性及实验条件综合考虑，并严格遵守各方法的操作规范及注意事项，以确保测定结果的准确性和可靠性。